WB實(shí)驗(yàn)代測(cè)實(shí)驗(yàn)步驟

更新時(shí)間：2018-04-17

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　　WB實(shí)驗(yàn)代測(cè)實(shí)驗(yàn)步驟

　　1.收集蛋白樣品(Protein sample preparation)

　　可以使用適當(dāng)?shù)牧呀庖?，例如Western及IP細(xì)胞裂解液、RIPA裂解液等，裂解貼壁細(xì)胞、懸浮細(xì)胞或組織樣品。對(duì)于某些特定的亞細(xì)胞組份蛋白，例如細(xì)胞核蛋白、細(xì)胞漿蛋白、線粒體蛋白等，可以參考相關(guān)文獻(xiàn)提取這些亞細(xì)胞組份蛋白，也可以使用試劑盒進(jìn)行抽提，例如細(xì)胞核蛋白與細(xì)胞漿蛋白抽提試劑盒

　　收集完蛋白樣品后，為確保每個(gè)蛋白樣品的上樣量一致，需要測(cè)定每個(gè)蛋白樣品的蛋白濃度。根據(jù)所使用的裂解液的不同，需要采用適當(dāng)?shù)牡鞍诐舛葴y(cè)定方法。因?yàn)椴煌牡鞍诐舛葴y(cè)定方法對(duì)于一些去垢劑和還原劑等的兼容性差別很大。

　　2.電泳(Electrophoresis)

　　(1)SDS-PAGE凝膠配制

　　SDS-PAGE凝膠可以參考一些文獻(xiàn)資料進(jìn)行配制

　　(2)樣品處理

　　在收集的蛋白樣品中加入適量濃縮的SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液。例如2X或5X的SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液。使用5X的SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液可以減小上樣體積，在相同體積的上樣孔內(nèi)可以上樣更多的蛋白樣品。5X的SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液可以參考相關(guān)文獻(xiàn)資料配制

　　(3)上樣與電泳

　　冷卻到室溫后，把蛋白樣品直接上樣到SDS-PAGE膠加樣孔內(nèi)即可。

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